反义核酸包括反义 RNA（antisense RNA）和反义DNA(antisense DNA)两种，是指与靶RNA（多为mRNA）具有互补序列的RNA或DNA分子。它通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与基因表达的调控。通常把转录产生反义RNA的基因称为反义基因（antiscnse gene）或反义DNA，因其与转录靶RNA的目的基因是反义的［1］。参与基因表达调控的反义RNA最早是在原核生物中发现的，其后又陆续在原核生物中发现了多种不同的天然存在的反义RNA，如在质粒的复制、Tn10的转座、噬菌体的繁殖等诸多过程中均发现了反义RNA调控系统的存在，显示原核生物中存在反义调控系统是一种普遍的现象。在真核生物中虽然迄今未能找到反义RNA调控系统，但却检测出了许多具有互补碱基序列的小分子RNA，推测其中有一部分参与了基因表达的调控，可能起着类似反义RNA的作用［2］。广义地说，反义核酸还包括在体外人工合成的碱基序列与靶mRNA互补的DNA或RNA片段。反义核酸对基因表达的有效调控给人类带来了新的希望，即有可能把反义核酸作为一种生化药物应用，征服人类的大敌如癌症、病毒类引起的疾病、艾滋病和遗传性疾病等。
1 反义核酸的作用机理
反义核酸作用原理基于碱基配对规则，可通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与对相关基因表达的调控。其作用方式可能有：①反义RNA与mRNA结合形成互补双链阻断核糖核蛋白体同mRNA的结合，从而抑制了mRNA翻译成蛋白质的过程。②反义DNA能与靶细胞形成一种三链核酸(triple helix nucleic acid),它通过作用于控制基因转录的转录子、增强子和启动子区，对基因的转录进行调控。③反义核酸与mRNA的结合可阻挡mRNA向细胞质的运输。④反义核酸与mRNA结合后使得mRNA更加易被核酸酶识别而降解，从而大大缩短mRNA的半衰期。上述四种作用途径都可表现为对基因表达的抑制或调节，且这种调节是非常特异性的［3,4］。
在人细胞染色体内有30亿对碱基，如果4个碱基的数目大致相同，并在整个基因中随机分布，则平均12个碱基长度的序列不应该重复出现。因而针对癌基因、病毒基因或遗传基因来设计合成反义核酸是理想的基因治疗途径。常见的获得反义RNA的方法与基因工程方法相同。首先，以mRNA为模板合成互补配对的DNA单链，然后以合成的互补DNA单链为模板再合成另一条DNA链，此双链DNA片段就是目的基因的片段。将目的基因片段反向插入适当的载体中，然后将重组载体导入细胞，当重组载体基因表达时，由于是反向插入，因此，启动引导的不是目的基因的转录，而是与目的基因互补的反义基因的转录，从而得到反义RNA。
2 反义核酸类药物必需符合的条件
假设应用一个反义RNA或反义DNA来抑制某种肿瘤，病毒性疾病或遗传性疾病的基因表达而实现治疗目的，对此反义核酸应符合以下要求（又称三个S）。
2.1 选择性（selectivity）
目前，许多癌基因和病毒基因的序列已经弄清。因此，只要对其mRNA序列选择一个区段设计所要合成的反义DNA/RNA序列。这些区段主要包括：5′端帽结构区；mRNA的起始编码区或编码区；核前体mRNA的拼接区；反转录病毒的引物区等。这些区段均为基因表达的关键区或敏感区，对基因的调控可起“四两拨千斤”的作用。一般而言，只要人工设计合成12个以上碱基序列的反义DNA或反义RNA（即反义寡脱氧核苷酸或反义寡核苷酸），就足以使此反义核酸与靶mRNA形成结合作用，且这种结合调节是非常特异性的。
2.2.1 碱基修饰
碱基是ASON或ASODN（下同）与靶基因通过氢键形成而直接接触的部位，而氢键形成又是ASON发挥功能的必要条件。因此，该部位的修饰应以不影响氢键形成为前提。在胞嘧啶的5位点甲基化是最常使用的碱基修饰手法，此外，碱基修饰基团的种类还包括三氟甲基、炔丙基、咪唑丙基等等［5，6］。
2.2 稳定性(stability)
反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)或反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucletide,ASODN)的功能在很大程度上取决于其稳定性，ASON或ASODN在体内生理条件下，很容易被各种核酸酶降解，这样就根本无法达到阻遏mRNA翻译的目的。因此，人们对反义核酸的结构进行各种化学修饰以提高其稳定性，增加对核酸酶的抗性。
2.2.2 骨架修饰
核苷酸通过磷酸二酯键连接成核酸或ASON，磷酸二酯键是受核酸酶作用（水解）的敏感位点，在体内生理条件下半衰期仅数分钟。因此，在正常ASON未与靶基因结合前即已降解，根本无法发挥其功能。由于ASON发挥其特异性抑制基因表达的关键是碱基排列顺序，而与易降解的磷酸和糖环形成的磷酸二酯键骨架无关，因此。可将此骨架换成聚酰氨（nylon）、吗啡啉（mophilin）、碳胺酯（carbamate）或肽骨架（peptide），它们不仅非常稳定，而且也有相当的抗病毒活性。
ASON或ASODN的磷酸二酯键是核酸酶作用的化学键，而磷原子更是核酸酶攻击的中心，对该原子稍加改变即会大大影响酶的降解作用。故研究最多的化学修饰即是磷原子，如硫代、甲基化、胺化和酯化等等。此外，参与骨架形成的糖环修饰包括α构型、1′/2′-位取代及3′-3′/5′-5′连接3种。α构型修饰是指将天然DNA或RNA的β型核苷键替换成α构型，使核酸酶不能有效地识别其磷酸二酯键。戊糖的1′/2′位引入某些取代基如简单烷基、烷化剂、嵌入特殊功能分子后，也使ASON或ASODN具备更强的核酸酶抗性。3′-3′/5′-5′连接修饰则是使合成一类具有3′-3′/5′-5′颠倒连接末端的ASON（INV-ASON），结果使核酸酶不能识别［7～9］。
2.3 溶解性(solubility)
从反义核酸的作用原理来看，它必须溶解于水且又能透过细胞膜，进入细胞中才能与mRNA发生作用。故ASON或ASODN（下同）的水溶性与脂溶性必需有一个恰到好处的平衡。由于ASON带负电荷且有较强的亲水性，因此不易与带同样电荷的靶细胞接触，更不易透过由脂质双分子层构成的细胞膜进入细胞内。化学修饰是解决这一问题的有效手段，修饰途径包括引入亲脂性基团和改变其负电性等。
在ASON分子上连接亲脂性基团能加强其亲脂性，从而有效地增加其透过生物膜。亲脂性基团通常通过磷酸或羧酸酯键连接于ASON末端的5′-OH或3′-OH上。最常用的亲脂性基团有脂肪酸（醇），胆酸或胆固醇等。另一项有关技术叫Lipofection，是把多阴离子的ASON按电性结合到阳离子性的修饰磷酯上，以组成具有脂质样释药能力的复合物。也可将ASON与带有多价阳离子的多聚氨基酸缩合制备成多聚氨基酸-ASON复合物，一类是Lemaitre等制备的多聚赖氨酸-ASON(PLL-ASON),另一类是Zhang等制备的多聚鸟氨酸-ASON（PLL-ASON）［10,11］。
3 几种人工合成的反义寡脱氧核苷酸及其应用前景
具有潜在治疗作用的反义RNA片段可以用体外重组或化学合成方法制备，但比较起来RNA不如DNA来得稳定，而DNA又较容易合成，在序列相同时DNA与RNA都可以与靶m RNA杂交。因此，目前在反义技术研究较多的是几种合成的反义DNA。按上述反义核酸的要求，主要对DNA片段中的磷酸部分进行修饰。
3.1 正常DNA片段（ODN）
ODN是指化学合成的、按正常磷酸二酯键连接的DNA片段。美国Zamecnik实验室早在1978年就报道利用人工合成的与劳氏肉瘤病毒（RSV）的m-RNA的5′-和3′-端重复序列互补的β聚核苷酸，能抑制该病毒增殖，使培养的鸡胚细胞不被转化为癌细胞［12,13］。他们还合成了一些DNA片段以观察对艾滋病毒（HIV）的抑制作用：其中12聚、20聚和26聚脱氧核苷酸序列是与病毒mRNA的某些易于进攻的区域互补的。结果发现20聚片段对逆转录酶有67％抑制，对其表达产物P15和P24蛋白分别有95％和88％抑制［14］。裘慕绥等报道反义ODN对小鼠腹水瘤病毒（SRSV）这种逆转录病毒有抑制作用，用互补于病毒RNA基因5′端引物tRNA区的15聚ODN，可使病毒感染宿主细胞生长抑制90％［15］。许毅等针对人胃癌基因（c-Ha-ras 基因）合成了2个15聚ODN，一个是与c-Ha-ras mRNA的前三个密码子及其上游区的核蛋白体结合点附近的单链区互补，另一个是与细胞核内未成熟的c-Ha-ras mRNA第一个内含子3′端及第二个外显子5′端区域互补，它们可分别阻断c-Ha-ras mRNA的翻译和拼接过程，从而降低c-Ha-ras癌基因的表达水平［16］。
3.2 甲基化磷酸型DNA片段（M-ODN）
对化学合成的反义ODN的磷酸二酯键进行化学修饰，使甲基取代磷酸二酯键部分中的羟基而得到ODN的类似物，称之为M-ODN。甲基化的结果使原DNA带众多负电荷变成非离子型分子而增加脂溶性，它能完整地穿过细胞膜并且不易被核酸酶水解，能与互补的核酸区段形成复合物。这方面最出色的工作是由美国Miller等实验室完成的。他们曾报道M-ODN可与大肠杆菌16s rRNA的基因序列（Shine-Dalgarno序列）杂交而阻断其增殖［17］。Blake等报告特异性的M-ODN能与相应的兔网织红细胞及其裂解液中的核酸片段内mRNA模板起始编码区5′端杂交，有选择性地抑制珠蛋白mRNA的活性，干扰其产物N蛋白，NS蛋白的合成［18］。M-ODN的缺点是当其长度超过12个碱基对时在水中就不溶解。尤其是在磷原子上引入甲基后即造成手性，理论上带有n个碱基对的M-ODN可以具有2n-1个对映异构体，这无疑会给分离纯化带来困难。
3.3 硫代磷酸型DNA片段（S-ODN）
这是磷酸二酯键部分中的羟基被巯基取代而生成的ODN类似物。它的特点是：虽然仍带负电荷，却可完整地进入细胞，抗核酸酶降解的能力也较强，水溶性也较好，并且能与互补的核酸区生成复合物以抑制mRNA的翻译。目前已知艾滋病毒（HIV）的BIO基因组中存在一种art/trs外显编码子Ⅰ的RNA序列，它能调节HIV的复制及转录，故针对这些密码子区段的序列 人们合成了一系列的S-ODN。14聚脱氧核苷酸的S-ODN在25 μmol/L浓度时即对HIV的细胞病变有95％的抑制作用，而ODN和M-ODN只分别产生4％和10％的抑制。慢性粒细胞白血病（CML）患者白血病细胞中含有Ph染色体，它是9号染色体上c-abl原癌基因易位到22号染色体形成bcr/abl嵌合基因，该基因编码一种具有酪氨酸激酶活性的P210bcr/abl蛋白（致癌蛋白）。针对bcr/abl嵌合基因的位点及C-myb癌基因序列，韩金祥等设计并合成了反义ODN与反义S-ODN，结果显示，两者均可抑制bcr/abl嵌合基因的表达，可诱导CML细胞凋亡，同时也抑制异常增殖。而反义S-ODN比反义ODN作用效果更好，表现在抑制效果快且持续时间长，抑制率达85.1%［19］。
4 反核酸问题与展望
对癌症、艾滋病一类病毒性疾病及遗传性疾病，迄今人们仍未能找到根治的途径和药物。反义核酸的发现与应用无疑是一个令人憧憬的途径，因为它对致病基因有特异性地抑制作用。目前在医药领域中进行的研究主要集中在反义核酸的合成及化学修饰，绝大部分是在体外进行药理试验，包括抗病毒（如HIV、HSV等）、抗原虫（如布氏锥虫）、抗恶性肿瘤的试验。但对反义核酸进入细胞的方式和过程，对核酸酶的稳定性、发挥作用的具体机制及在动物体内的试验则很少有报道，只有一些会议简报但实验数据甚少。另外，如何寻找更有效的合成方法并转化成可操作性的工艺技术，以便使大量制备反义核酸并对其剂型加以改造，使之能供动物体内试验和人体临床试用成为可能，也是亟待解决的问题。还有关于反义核酸的毒性和致突变性，就目前动物实验资料看是安全的，但仍须更深入进行这方面的研究，才能使反义核酸类药物真正满足药物应用的严格要求。
苏公网安备 32058302001205号